摘要 介绍天花粉蛋白的分子结构和功能的相互关系，天花粉蛋白基因在原核及真核生物中的表达及对真菌、植物病毒和害虫抗性的研究进展，提出了用天花粉蛋白基因进行生物防治的研究方向。
　　关键词 天花粉蛋白（TCS）；病虫害；生物防治
　　
　　天花粉蛋白（Trichosanthin，TCS）是从葫芦科药用植物栝楼块根中分离得到的单链核糖体失活蛋白（Ribosome Inactivating Protein，RIP），它是中草药天花粉的有效成分。根据《本草纲目》的记载，天花粉的主要功效是“通月水，治胞衣不下”[1]。天花粉蛋白不但在医学方面有很重要的价值，而且与植物的防御反应相关。它对病毒、真菌和昆虫有直接或间接的抑制和杀灭作用，能够抗烟草花叶病毒等7种病毒、稻瘟病菌等9种病原真菌及蚜虫等4类害虫。近年来，研究者们揭示了天花粉蛋白参与了植物细胞代谢、细胞死亡等生理调控过程，并诱发细胞的程序化死亡而导致细胞死亡[2]，天花粉蛋白在植物防御反应中扮演了重要角色。
　　
　　1天花粉蛋白的分子结构和功能相互关系
　　
　　1.1 天花粉蛋白的分子结构
　　天花粉蛋白分子是由247或248个氨基酸残基（其C端的氨基酸有Ala和Met的不均一性，即有一种TCS比另一种在C端多了一个Ala，不过这两种蛋白质的性质基本相同）组成的单一多肽链，分子量为26kD，等电点为9.4，属碱性蛋白。它是由19种氨基酸构成，不含二硫键、糖基侧链，也没有磷酸化位点等其他蛋白质修饰位点，是一种简单的蛋白质[3]。
　　潘克桢根据Collins提出的TCS氨基酸序列，通过重建TCS分子模型并在2.6 ?魡分辨率进行晶体修正，得到可靠的TCS分子的结构[4]。该结构表明TCS分子的二级结构由8段α螺旋和13条β链组成，α螺旋长短不一，α4、α5、α6为三段连续的α螺旋，且α5与活性中心有关；13条β链共组成4个β折叠层，最大的β折叠层由6条β链组成。从整体分子来看，α螺旋相对集中在蛋白质分子内部，而β链构成的β折叠层则分布在分子表面，这是TCS分子的显著特点。
　　
　　1.2天花粉蛋白的空间结构和功能的相互关系
　　徐琼芳等将TCS基因中编码22位的精氨酸的AGA密码子，定点突变成编码为亮氨酸的CTA密码子，并导入大肠杆菌BL21中得到高效表达，表达产物也能使核糖体失活，但功能降低10%[5]。如果将活性中心160位的Glu和189位的Glu都变成Ala，则其活性比TCS降低1 800倍。Shaw 等对天花粉蛋白Tyr14和Arg22进行了突变研究，结果表明，Arg22的改变对天花粉蛋白的活性也有较大的影响[6]。已经发表对天花粉蛋白活性有较大影响的其他位点还包括Gln156、Tyr70、Arg163、Lys120-Ile121-Arg122-Glu123。此外，还可以采用删除部分基因片段的方法研究天花粉蛋白的结构与功能的关系。试验结果表明，天花粉蛋白的活性中心可能在110～174位之间，结构基因N端虽然不含有活性中心，但是对N端的突变影响了蛋白质的空间结构，因而降低了TCS的酶活；结构基因C端的部分缺失可降低TCS的免疫源性[3]。
　　
　　2天花粉蛋白基因在原核及真核生物中的表达
　　
　　2.1天花粉蛋白基因在原核中的表达
　　Shaw重组了由栝楼根cDNA库中分离到的TCS基因，除去了信号肽，保留了成熟肽及C末端19肽的序列，同时增加了一个Met密码子作为起始密码，使TCS基因在大肠杆菌中表达[7]。鲍一明将含有N端信号肽编码序列的TCS基因克隆到大肠杆菌表达载体pJLA502质粒中，基因位于串联启动子PrPL控制下；在PrPL启动子上游存在着温度诱导的调控元件CI857，表达质粒转化大肠杆菌DH5α。经温度诱导后，得到了29kD的融合表达蛋白，产量约占细胞总蛋白量的5%[8]。聂慧玲等将分离得到的TCS前体基因进行适当改造，即在编码成熟肽的DNA序列前引进NcoⅠ位点CCATGG，同时将编码的第一个氨基酸残基从Asp改为Met，或引进NdeⅠ位点CATATG，在第一个氨基酸Asp前加上Met；另外在编码成熟肽的尾部DNA序列上加进终止密码子TAG和BamHⅠ位点GGATCC，并消除原来的NcoⅠ位点。然后，将改造好的TCS基因重组进pET-2d或pT7-7质粒载体，再转化受体菌BL21。用IPTG诱导进行表达。检测到重组TCS产物约占总蛋白的1/3以上，以溶解和包涵体两种形式存在。重组TCS对蛋白质合成的抑制活力及免疫活性均与天然的TCS相似[9，10]。
　　
　　2.2天花粉蛋白基因在真核中的表达
　　天花粉蛋白基因不但在原核生物中表达，同时也可在真核生物中表达。吕万革等用TCS成熟肽基因在酵母中获得了表达[11]。鲍一明等将TCS基因克隆到植物中间载体pE3质粒中，此质粒含有3个能在植物细胞中表达的基因：TCS基因、卡那霉素抗性基因（NptⅡ）及胭脂碱合成酶（Nos）标记基因。烟草受体材料G28用叶盘转化后，经过一系列筛选、培养得到了转化植株，并在烟草叶片中检测到表达产物[8]。储瑞银等利用杆状病毒为载体，获得了含TCS的重组病毒BmTCS，在家蚕体内表达了TCS基因[12]。姜国勇等构建的双元载体pBI121TG24，使TCS与GUS基因偶联在35S启动子的下游，利用根癌农杆菌介导，先后在烟草、小麦、水稻和番茄中表达，通过接种烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）于转基因番茄的叶片上，20d后未见两个病毒的症状表现[13]。天花粉蛋白基因在真核生物中的表达，可以显著提高真核生物的抗病虫能力。
　　
　　3天花粉蛋白对植物病虫的抑制作用
　　
　　3.1天花粉蛋白对真菌的抑制作用
　　长期以来，真菌病害的防治一直是人们所十分关注的问题。真菌病害是植物病害中最严重的一类，几乎所有的高等植物都受到不同程度的危害。胡苹等发现天花粉蛋白对小麦赤霉病菌、玉米大斑病菌、瓜果霜霉菌、黑曲霉、绿色木霉、烟草赤星病菌、棉花枯萎病菌、稻瘟病菌和西瓜枯萎病菌9种真菌都有抑制作用[2]。明小天等将天花粉蛋白基因与35S启动子融合，通过改进的基因枪技术，转入了中花8号和明恢63中，获得了天花粉蛋白稳定表达的阳性植株。在真菌侵染实验中，不同的转基因阳性植株对稻瘟病的抗性都明显增强，并且在R1和R2代中，得到了相同的结论。同时，还发现天花粉蛋白作为外源基因的引入并没有对水稻的生长发育产生影响[14，15]。
　　
　　3.2天花粉蛋白对植物病毒抗性的研究
　　天花粉蛋白对病毒具有广谱的抗性。转天花粉蛋白基因的烟草对非洲木薯花叶病毒和胡萝卜花叶病毒具有抗性[16]。姜国勇采用叶盘法，通过根癌农杆菌将TCS基因和GUS基因偶联转化番茄，获得了TCS－GUS基因表达的再生植株，转基因番茄植株TP3和TP11对TMV和CMV均表现出较强的抗性[17]。徐琼芳利用基因枪法将TCS基因转入小麦中，通过田间抗病性鉴定结果表明，TCS基因能够在小麦遗传背景中进行表达，并对小麦黄矮病有较强的抗性[18]。迄今为止，人们已了解天花粉蛋白对病毒的抗性，但对其抗病毒的机理不是很清楚。一般认为天花粉蛋白之所以对病毒具有抗性，是因为它能使寄主核糖体丧失其蛋白质合成的能力，致使受病毒侵染的寄主细胞死亡，使侵入的病毒无法进行复制而消亡。
　　

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