摘 要：从植物组织中提取总RNA是进行植物分子生物学某些方面研究的必要前提，通过选用5种不同的试剂，我们找到一种新的RNAplant分离试剂，可以很有效的提取苎麻叶、茎皮、雌花、果的RNA，且质量很好，可以进行cDNA的合成和RT-PCR等下游实验，并对不同试剂提取和多糖、多酚的去除进行了讨论．
　　关键词：苎麻：RNA；提取：
　　中图分类号：Q331
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007-7847(2007)01.0021.04
　　
　　从植物组织中提取总RNA是进行植物分子生物学某些方面研究的必要前提，如进行Northom杂交分析，纯化mRNA以用于体外翻译或建立cDNA文库，RT-PCR及差示分析等分子生物学实验，都需要高质量的总RNA，目前常用于植物材料RNA提取的方法有胍法、热硼酸法，CTAB法、SDS法等，这些方法对于提取某些植物的总RNA是有效的，但对另外一些植物来说，却并不一定是好的方法，因为不同植物组织的细胞内外成分复杂多变，在使用某些方法提取RNA时会起干扰作用，如LiC1沉淀，或造成RNA的降解、丢失，或得到的RNA样品含杂质较多而干扰以后的分析研究工作，或者根本得不到RNA，原因是某些植物的组成成分和结构特点不同造成的，在结构上，一些植物具有更为坚硬的细胞壁，除了含有蛋白质、多糖等杂质外，同时含有更多的多酚化合物、木质素、纤维等物质，这些因素决定了这些植物组织RNA提取技术上的特殊性，
　　苎麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)是荨麻目(Urticales)荨麻科(Urticaceae)苎麻属(Bochmeria)的多年生草本植物，起源于中国，苎麻主要以收获纤维为目的来栽培，还可以用来造纸，做饲料，生产工业酒精，以及入药等，苎麻含有大量的多糖，色素，酚类等物质，陈建荣使用Trizol试剂成功提取苎麻幼嫩茎段RNAt，程超华报道了CTAB法提取悬铃叶苎麻花序RNA的方法，但是我们通过大量实验，尝试了几种方法后，发现以上介绍的方法对苎麻组织的RNA提取时不是成本太高就是费时费力，本文使用一种新的RNAplant分离试剂，可以很有效的提取苎麻雌花、果实、叶片、茎皮的总RNA，且质量很好，可以进行mRNA的抽提、cDNA的合成、RT-PCR等下游实验，而且性价比较好，省时省力节约成本。
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 植物材料
　　幼嫩的苎麻(Boehmeria nivea(L.)Gaudh)雌花、叶片、果实、茎皮都取自中国农业科学院麻类研究所“国家种质长沙苎麻圃”中地方品种的藤山鸡骨白，在8月上旬-9月中旬取样，每份材料都分装于5mL冻存管后立即放于液氮中，后取出放于零下80℃冰箱储存。
　　
　　1.2 用具的处理与溶液的配制
　　所有用于RNA提取的用具的处理与溶液的配制均按文献[14]要求进行.1)RNAplant抽提液购自天根生物有限公司(DP407-1，TIANGEN)；2)用DEPC处理的5mol/L NaCI；3)用DEPC水配置的75％酒精；4)用DEPC水配置的5mol/LKAc；5)新的无水乙醇；6)新的氯仿；7)新的异丙醇；8)Millipore 0.22 μm一次性过滤头；9)DEPC水；10)一次性注射器。
　　
　　1.3 总RNA提取步骤
　　1)在10 mL无RNase离心管中加入5 mL抽提液，称取苎麻各部分材料各约0.5g，在液氮中迅速充分地研磨成粉末状，收集进10mL离心管中，迅速激烈振荡5min，室温平放5min，
　　2)在4℃10000r/min离心5min．
　　3)取上清到新的10mL无RNase离心管，重复第2)步。
　　4)取上清到一次性注射器，用0.22μm一次性过滤头过滤
　　5)测量过滤所得的上清体积，加入0.2倍体积5mol/L NaCl，混匀
　　6)加入0.6倍体积氯仿，上下颠倒混匀，
　　7)4℃10000r/min离心30min，取上层水相到新的无RNase离心管。
　　8)加入0.9倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。 9)4℃10000r/min离心30min，弃掉上清，注意不要倒出沉淀，加入5～10mL 75％乙醇，
　　10)4℃10000r/min离心5min，小心倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余少量液体可再次离心收集，然后用枪头吸出弃掉。
　　11)加入70μL无RNase水，吹打几次溶解RNA，－70℃保存。
　　
　　1.4 RNA质量分析
　　取4μL RNA溶液用无RNase水稀释100倍后，使用UNICAM Heλios-α型核酸蛋白仪进行A₂₆₀和A₂₅₀的测定，以A₂₆₀计算RNA的浓度(当A260=1时相当于40mg/L的RNA)，以A₂₆₀/A₂₈₀的比值评估RNA的纯度。
　　
　　1.5 RNA的琼脂糖电泳检测
　　取5μL所得的RNA，加1μL6×loadingbuffer后于1.2％的琼脂糖胶上电泳，电压为6V/cm，电泳15－20min后，凝胶成像仪照相分析(最好是变性胶)。
　　
　　1.6 RT-PCR分析
　　用Oligo(dT)₁₈为引物在TIANGEN公司的M-MLV Reserse Transcriptase的作用下合成第一链cDNA，对苎麻不同部位材料合成的cDNA利用NCBI公布的苎麻ACTIN基因的mRNA序列，用Primer premier5.0软件设计一对特异引物(P1：5－GCTCCGTFGAACCCTAAG-3’和P2：5’－GCTCCGATFGTGATGATTT-3’)进行PCR实验，理论扩增片段420bp，反应程序是94℃2min；94℃45s，55℃45s，72℃45s(30个循环)；72℃5min结束PCR。
　　
　　2 结果分析
　　
　　2.1 4种苎麻组织RNA的紫外吸收测定结果(见表1)
　　
　　从提取的4个不同组织的紫外吸收值看，利用RNAplant提取的苎麻4个组织得的RNA都达到了分子生物学实验的要求，蛋白和多糖等污染较少，可以进行下游实验，而且对于不同的组织所提的质量和数量略有不同，每克材料以叶片得到的RNA量最多也最好，其次是茎皮，然后才是雌花和果实，这是因为在雌花和果实中多糖和酚的含量大大增加的缘故。
　　
　　2.2 RNA的琼脂糖电泳检测
　　图1是使用RNAplant提取的苎麻叶片、茎皮、雌花和果实的RNA非甲醛变性琼脂糖凝胶电

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