摘要 多酚氧化酶（PPO）是细胞内酶促褐化反应的主要催化酶类，同时PPO催化的反应还可应用于多巴药物的生产、含酚污水的净化等方面。现在已经从多种植物和真菌中分离和克隆了PPO及其基因。阐述了多酚氧化酶的结构与功能特点，总结了目前已克隆的植物和真菌多酚氧化酶基因，分析其表达特性，并介绍了转基因方面的研究现状。
　　关键词 多酚氧化酶；酪氨酸酶；酶促褐化；基因克隆
　　中图分类号 Q946.5文献标识码A文章编号1007-5739（2008）18-0014-04
　　
　　多酚氧化酶（polyphenol oxidase，简称PPO）是一类普遍存在于植物、动物、真菌和细菌中的金属蛋白酶。PPO功能包括甲酚酶（Cresolase，EC.1.14.18.1，将单酚氧化为二酚）、二酚氧化酶/儿茶酚氧化酶（catecholase，EC.1.10.3.1，将二酚氧化为醌）。现在大部分文献将具有二酚氧化酶功能的酶统称为多酚氧化酶，不管是否具有单酚氧化酶的功能[1]。真菌中研究较多的是酪氨酸酶（tyrosinase）和漆酶（laccase）。
　　PPO在生物体酶促褐变、体内色素合成的过程中起关键的作用，尤其在果蔬酶促褐变过程中起重要作用。因此，对PPO及其基因的研究具有巨大的理论和应用价值。PPO在植物体细胞中定位于类囊体中，而其催化底物位于液泡，所以只有在亚细胞结构遭到破坏时，褐化反应才迅速发生。
　　近年来，对PPO的研究主要集中在其分布、特性、功能、酶活抑制等方面，对PPO基因的染色体定位、克隆、表达分析及基因转化的研究也屡见报道。目前已在甘蔗、马铃薯、西红柿、苹果、梨、葡萄、杨树、杏、茶树等植物中克隆了PPO基因。真菌中最早研究的是双孢蘑菇（Agaricus bisporus）PPO及其基因[2]，近年来在白腐菌Pycnoporus sanguineus、Pycnoporus cinnabarirus等菌种中分离了酪氨酸酶，克隆了酪氨酸酶基因，并对其外源表达做了系统研究[3]。
　　多酚氧化酶的开发应用是一个具有广阔市场前景的领域。该酶可以用于生产抗氧化物，作为食品添加剂或药物。生产L-多巴药物，催化蛋白—蛋白、蛋白—多糖的交联，用于污水治理。在食品工业中，啤酒、果汁等饮料在储存期间常会出现浑浊和沉淀，这与其中含有酚或芳胺类物质有关。如果用酪氨酸酶预先处理麦芽汁，使其中的酚氧化后除去，则可提高啤酒的质量和透明度。
　　本文对多酚氧化酶基因的克隆研究、表达分析以及基因转化等分子生物学方面的研究现状进行总结和阐述，并对PPO的结构、功能、激活和抑制等方面的研究作一综述。
　　
　　1PPO的结构与功能
　　
　　1.1PPO蛋白结构
　　植物PPO以非活化的形式存在于类囊体中，多肽链中含有一个8~12KD的信号肽，前体蛋白为50~70KD。酶蛋白由N-端信号肽、中间高度保守的Cu结合区和C-端疏水区3部分组成。PPO的Cu结合区是该酶的主要功能区，包括CuA和CuB 2个区域，CuA区含3个保守的组氨酸和1个半胱氨酸，CuB含3个或4个保守的组氨酸[4]，类似于软体动物的血蓝蛋白（hemocyanin）。其他部分则对酶的构象、高级结构的形成和维持起作用。关于植物PPO蛋白结构相关内容已有详细的综述[5]。
　　真菌酪氨酸酶没有信号肽，推测其位于细胞质中，或结合于细胞器上[1]。真菌酪氨酸酶一般产于胞质中，大部分以非活性的形式存在。在体内受蛋白酶激活，切除C-端的部分序列后，转变成活化状态，其成熟过程与胰凝乳蛋白酶的成熟很相似。Agaricus bisporus中提取的AbPPO1和AbPPO2活性蛋白分别为43KD和47KD，但其基因AbPPO1、AbPPO2编码的蛋白推测分子量则是64KD[2]。
　　1.2PPO的功能
　　PPO在生物体内除了催化酚类物质的氧化，导致褐化外，还参与其他生化合成途径。它可能作为一种金属氧化还原酶，参与光合作用，与氧结合并传递分子氧，以调节叶绿体中有害的光氧化反应速度；参与其中电子传递，起能量转换作用[6，7]。PPO还参与花色的形成，Nakayama等在金鱼草等的提取物中发现了一种新的酶——金鱼草素合成酶（aureusidin synthase），它以查耳酮（chalcone）为特异性底物，催化类黄酮（aurone）的形成，而后者是花中黄色形成的主要原因。通过对金鱼草素合成酶及其cDNA的研究发现，它与PPO有很高的相似性（39%～51%），属于PPO家族[5]。
　　另外，现有很多的研究发现，PPO表达能提高植物的抗病性[2]，该结论已通过转基因实验得到证实[8]，其抗病机理还有待进一步研究。在真菌中，酪氨酸酶与孢子的形成和稳定性有关，与防御和毒性机理有关，还与其褐化和色素沉着有关[9]。由于对PPO的研究存在较大难度，许多的结论还缺乏足够的证据，因此，PPO的具体功能需要进一步深入研究。
　　1.3PPO的激活与抑制
　　在植物及真菌细胞内，PPO是以非活化态存在于类囊体中，而它的酚底物在液泡中，只有这种空间隔离被打破后，PPO才表现出酶活性。通常PPO前体被多种蛋白酶激活并裂解，去除一段肽段后，才转变成活化形式。在生物细胞内PPO在一定的发育时期会被激活，同时组织细胞在受到损伤、病虫害侵袭时，PPO活力也会上升。关于PPO的激活剂近年来有少量的报道，何光好研究发现0.5mmol/L SDS对烟草PPO活力有一定促进作用[10]；植物中大部分PPO的表达受到茉莉酸或茉莉酸甲酯的诱导[4]。
　　PPO的活力抑制是近几十年研究较多的课题。褐变问题一直是很多果蔬收获后保藏、加工等过程导致质量下降、经济价值降低的一个非常重要的因素。同样多酚氧化酶活性的高低也影响了茶叶、烟草的品质[11， 12]，因此，研究防止褐变的多酚氧化酶抑制剂是解决这一问题的一种重要途径。PPO活力可以通过降低储存温度、调节pH等方法来控制。在一般的工业及食品研究中，多采用抑制剂来控制酶活。目前研究的抑制剂大致有如下几类：一是与酶中的金属离子（如Cu2+）结合形成螯合物沉淀，如EDTA；二是还原剂，它将多酚氧化酶中的Cu2+还原为Cu+，还可将多酚氧化酶反应中生成的醌还原为酚，阻止醌的进一步氧化，如NaHSO3、抗坏血酸；三是含有SH基团，与PPO中的二硫键结合，致使PPO的构象改变，如硫脲、巯基乙醇；四是本身呈酸性或碱性，改变了PPO作用环境的pH值，如硼酸、柠檬酸等；五是含有较高浓度的游离Cu2+，对蛋白质有毒害作用，如铜试剂（CuSO4）。董新红在研究莴苣的褐变抑制中发现，将抗坏血酸、亚硫酸氢钠、氯化钙、柠檬酸4种试剂按一定浓度组合使用可以有效抑制褐变[13]。针对蘑菇多酚氧化酶，已发现大量的抑制剂，主要是酚、醛及其延伸物，它们有来自高等植物的，如黄酮类化合物，其机理是螯合活性区域的Cu，而醛类化合物可以和PPO肽链中的氨基形成Schiff碱，从而抑制酶活。
　　
　　2PPO基因的特点
　　
　　2.1PPO基因的家族性
　　从目前已克隆的20余种植物、真菌PPO基因来看，绝大部分PPO蛋白由多个基因编码，多则6~7个，少则2~3个。例如番茄PPO由7个核基因编码，PPOA、A′、B、C、D、E、F[14]；编码马铃薯PPO的基因已克隆有POT32、POT33、POT72、NOR333、P1[15]；从香蕉中已克隆了4个基因BPO1、BPO11、BPO34、BPO35[16]；苹果、杏、番薯、菠萝、烟草、蚕豆、杨树、小麦中都存在多个PPO基因；而在葡萄中目前才发现一个PPO基因。真菌的酪氨酸酶基因也是以家族形式存在于染色体上。
　　

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