摘要 在植物繁殖和遗传操作中，研究离体再生体系所面临的主要问题是胚胎发生能力和器官发生能力的丧失。愈伤组织体细胞胚胎发生能力的强弱对植物资源离体安全保存和生物技术遗传改良具有重要价值。对影响体细胞胚胎发生的外源因子、体细胞胚胎发生的分子基础，柑橘愈伤组织长期保存过程中DNA含量的变异和倍性的变化与体细胞胚胎发生能力的关系进行了综述。同时结合过去长期的研究经验、指出改变不同品种柑橘愈伤组织的基因型可能是提高其体细胞胚胎发生能力的有效途径。
　　关键词 柑橘；愈伤组织；体细胞；胚胎发生
　　中图分类号 S603.6 文献标识码A文章编号1007-5739（2008）14-0007-03
　　
　　植物组织培养中，愈伤组织经长期继代后分化能力的保存及遗传稳定性问题，一直是细胞工程研究中的重要课题[1-4]。已有不少报道指出，愈伤组织长期继代后，分化能力降低是较为普遍的现象[3]，像胡萝卜、烟草和水稻，在继代多次后，愈伤组织分化植株的能力就会完全消失[5，6]。但也有一些植物的愈伤组织在继代中，它们分化能力是可以很好保持的。如玉米，花粉愈伤组织继代2年后仍有很强的植株再生能力[6]；柑橘愈伤组织继代多年后仍有再生能力[7]。但是，有些柑橘愈伤组织一直维持在愈伤未分化状态，即使在甘油培养基上也很难形成胚状体，如山金柑、默科特桔橙、红马叙葡萄柚等。而有些柑橘愈伤组织在基本培养基上就能形成胚状体，如伏令夏橙、暗柳橙、GWZ等[8]。因此，掌握柑橘愈伤组织体细胞胚胎发生的机制有助于种质资源的保存和通过基因工程、细胞工程等分子生物学技术改良品种。
　　体细胞胚胎发生是指在离体条件下植物的体细胞通过与合子胚发生相类似的途径发育成新个体的过程。体胚发生现象最早有Steward等（1958）在胡萝卜根细胞离体培养时发现，后来又陆续在单细胞悬浮培养，原生质体培养，花粉培养中观察到[9]。体胚发生具有单细胞的特点（Polito et al，1989），为基因工程、细胞工程等生物技术改良品种提供了良好的实验体系。因此，20世纪70年代以来，这方面的研究与日俱增，已在43科79属114种植物中有体胚发生的报道。本文就近几年来在影响柑橘愈伤组织体细胞胚胎发生的外源因子、分子基础、柑橘愈伤组织长期保存过程中DNA含量的变化和倍性的变化与体细胞胚胎发生能力的关系方面的研究进展予以综述。
　　
　　1影响体胚发生的外源因子
　　
　　胚胎发生对于利用柑橘愈伤组织进行基因转化和理化诱变具有重要意义。前人对胚胎发生的影响因子的研究较多。研究表明：光、激素、糖代谢、DNA甲基化、秋水仙素等多种因素都影响着体细胞胚胎发生。
　　1.1激素对体胚发生的影响
　　Fiore等研究2，4-D 和4-CPPU对体胚发生的影响[10]：加2，4-D，柑橘体胚发生率为0%；加4-CPPU，体胚发生率为16%。而Varisai等认为，2，4-D和ABA结合使用，促进高频体胚发生、成熟、进一步发育[11]。Kaur等认为，2，4-D和KT结合使用促进体胚发生[12]。Haensch研究了TDZ诱导形态发生的反应。试验表明，所有TDZ的处理，全部再生[13]。但组织学检测，没有体胚形成。Panaia等发现细胞分裂素和TDZ促进体胚发生[14]。Giridhar等认为适当浓度的TDZ，促进体胚发生[15]。
　　Mauri等以橡树为材料，发现培养基中加入ABA抑制体胚2次发生而不影响体胚正常发芽[16]。Langhansova等（2004）认为，聚乙二醇（PEG）和ABA促进体胚成熟和植株再生。聚乙二醇（PEG）和ABA处理人参成熟的合子胚，再生率为70%，而未处理的再生率为31%。聚乙二醇（PEG）和ABA处理的有75%形成根，而未处理的全部未生根[17]。Wu等在研究棉花体胚发生时发现，激素的有无与不同激素的搭配使用，形成球形胚的比率不同。无激素，38.3%胚性愈伤分化成球形胚；适当浓度的IBA和KT搭配使用，86.7%胚性愈伤分化成球形胚[18]。Ramarosandratana等（2004）认为，控制云杉体胚发生与生长素的极性运输可能不直接相关，超剂量NAA产生内源生长素的积累，对体胚发生有害。Wu等（2004）处理蝴蝶兰的根，研究生长素和细胞分裂素对体胚形成的影响，发现适当浓度的KT和ZT 比其他生长素和细胞分裂素更有效。
　　Jimenez 等利用甘油诱导柑橘体胚发生，试验发现：愈伤组织转入甘油培养基后5d，细胞分裂素水平较高；ABA和细胞分裂素60d时继代比30d继代时水平低，吲哚乙酸、赤霉素含量不变[19]。柑橘内源激素水平因基因型差异而显著不同，甚至个体发育相似的不同基因型的激素水平存在显著差异。
　　1.2糖代谢对体胚发生的影响
　　Lipavska等研究了松树糖代谢在体胚发生中的作用，发现外源糖供应导致内源水平的改变[20]。Mauri等认为较高浓度的蔗糖有抑制橡树发芽的作用[16]。张俊娥等认为蔗糖和葡萄糖能有效诱导柑橘体胚发生，山梨醇和甘露醇完全抑制体胚发生，蔗糖和葡萄糖促进胚胎2次发生，但蔗糖浓度较高（4%或5%）不利于胚胎的继续发育[21]。
　　1.3DNA甲基化对体胚的影响
　　Leljak-Levanic等研究2，4-D和氮源对体胚发生的影响时发现，体胚发生期间DNA甲基化发生变化。在胚胎发生早期DNA甲基化程度最高。同时，外源生长素影响DNA甲基化程度，培养基中去掉生长素时，DNA甲基化程度降低[22]。
　　1.4秋水仙素对体胚发生的影响
　　秋水仙素是一种毒性极强的植物碱[23]。它能使正在分裂的细胞不形成纺锤丝，从而使染色体数增加1倍成为多倍体。柑橘愈伤组织对秋水仙素的耐药性较高。即使秋水仙素处理11d后，愈伤组织也没有表现出药害反应。把秋水仙素处理11d的愈伤组织转入甘油培养基，发现秋水仙素对柑橘愈伤组织体胚发生能力的影响并不明显[21]。
　　Obert等认为秋水仙素能诱导玉米体胚发生，玉米花药培养的最初3d，培养基中加TIBA和0.02%秋水仙素进行冷处理效果最好[24]。Rey等利用秋水仙素促进冬青属植物体胚发生，所有处理虽降低了发育胚胎数目，但一些处理可诱导胚胎继续发育。152个再生植株中只有2个四倍体[25]。Herrera等（2002）利用秋水仙素诱导咖啡胚胎发生。Zhou等利用秋水仙素处理芸薹，提高胚胎发生能力，但高浓度秋水仙素（1 000mg/L）能够抑制胚胎发生[26]。
　　
　　2柑橘愈伤组织体细胞胚胎发生的分子基础
　　
　　2.1体细胞胚胎发生的分子基础
　　随着植物组织培养技术的提高，在植物体细胞胚胎发生的全能性表达过程中，人们已不是局限于形态学、细胞胚胎学以及生理生化的研究，而是在这些基础上，深入探讨体胚发生的分子机制。大量的研究表明，植物细胞具有全套基因作为体胚发生的分子前提，外源理化因子的诱导（外源激素的刺激，大量碳源提高C/N迫使细胞进入生殖状态），内源理化因子（包括原生质体胶体性质、激素、ATP、cAMP及内环境pH值等）发生相应的变化，结果导致一系列酶的活化与钝化，接着RNA合成被活化，DNA合成加速，新的蛋白质（酶）合成与周转也活化，导致细胞的活跃分裂和球形胚的形成。球形胚处于高胚性状态，虽在形态上看不出分化现象，但在生理上已出现了差异，为即将出现的形态分化奠定分子基础。在内源信息作用下，通过转录与翻译水平复杂而精巧的调控，基因在时间和空间上得以选择性激活和表达，导致细胞生理代谢的阶段性和区域性差异，结果用于形态建成的物质基础也不同，于是实现了胚胎发生（杨和平等，1991）。细胞增值的分子基础是DNA的复制，细胞分化的基础是基因差异表达，而细胞的分化又是多细胞生物个体形态发生的基础（催凯荣等，2000）。体胚发生的实质是基因表达结果。因此，对体胚发生机制的探讨，在于寻找调节体配发生的关键基因，并借助其表达规律从而真正了解体胚发生的分子机制，而不是其生理生化特性。
　　

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